Diagnóstico Molecular do HPV

Diagnostico Molecular do HPV

Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Coordenador do Laboratorio de Ginecologia Molecular
Departamento de Ginecologia
Universidade Federal de Sao Paulo-Escola Paulista de Medicina

Introdução

O Papilomavírus humano é um DNA vírus epiteliotrófico cujo capsídeo de 55 nm encerra genoma circular contendo cerca de 8000 pares de bases. Originalmente esses vírus eram classificados em conjunto com os poliomavírus formando um grupo taxonômico único chamado Papovaviridae.

Na atualidade, entretanto, diferenças no tamanho dos vírions (50 nm para os poliomavírus) e nos padrões de replicação justificaram a sua separação em dois grupos distintos. O sistema atual de tipagem dos HPV’s é baseado em eventuais diferenças nas regiões de E6/E7 e L1 do genoma viral.

 Um novo tipo de HPV deve, por definição, apresentar homologia menor que 90% com outros tipos virais em relação a essas regiões. Um sub-tipo viral apresenta, por sua vez, de 90 a 98% de similaridade para essas regiões, considerando-se variante viral aquele vírus que possui homologia maior que 98% (van Ranst et al; 1993).

No presente capítulo almeja-se fornecer ao leitor as bases moleculares, em especial aquelas onde o HPV desempenha importante papel, as quais acredita-se estejam envolvidas no surgimento da neoplasia invasora do colo uterino.
Da mesma forma fornecemos ao leitor alguns dos aspectos mais atuais da aplicação dos testes moleculares na detecção do HPV além de aspectos práticos como a coleta do material biológico e os locais  para sua obtenção.

Finalizando a introdução salientamos como um dos aspectos mais importantes e indispensáveis desse capítulo a necessidade da realização concomitante de exame citológico cérvico-vaginal (Papanicolaou) bem como colposcopia criteriosa dos casos suspeitos. O que tem valor, nos dias atuais, é a análise em conjunto de todos os métodos.

 

O Genoma dos Papilomavírus


 A organização molecular do genoma dos Papilomavírus pode ser melhor entendida de acordo com a seguinte figura:


  

0 -----------------------------------------------------------------------------7906 pares de bases
                                                                               
Fig. 1 -  Organização genômica do HPV 16

Os genes que compôem o genoma viral dos HPV’s podem ser divididos em dois grupos funcionais: Late “L” (genes tardios) e Early “E” (genes precoces). Vale ressaltar que na região de transição entre os genes tardios e precoces existe uma região controladora da expressão genética e da replicação do DNA não mostrada nessa figura.


O gene E1

A região codificadora do gene E1 leva à produção de uma fosfoproteína de 68kDa com atividade helicásica e ATPásica intrínseca além de possuir alta afinidade pelo DNA. A proteína E1, em conjunto com a proteína E2, formam o complexo E1-E2 sendo esse de extrema importância nos mecanismos de replicação viral.

O gene E2

A proteína codificada pelo gene E2, além de controlar a transcrição de outros genes como E6 e E7, parece possuir atividade estimuladora da função da proteína supressora do crescimento tumoral p53. De fato, alguns autores demonstraram que a expressão de E2 pode resultar em apoptose (Desaites et al; 1997).


O gene E3

Não existe função estabelecida para esse gene até o momento sendo que os Papilomavírus humanos não possuem esse gene.

 

O gene E4

A função da proteína codificada pelo gene E4 ainda está para ser melhor esclarecida acreditando-se que a sua produção esteja ligada à diferenciação terminal dos queratinócitos. A interação entre a proteína E4 e as citoqueratinas resulta para alguns na formação da coilocitose (Roberts et al; 1997).

O gene E5

Esse gene não aparece em todos os tipos de HPV, além de poder estar truncado em alguns outros. À proteína E5 tem-se atribuído papel relacionado a transformação induzida por HPV’s tipo 1, 6 e 16 (Crusius et al; 1997). Com relação às taxas de proliferação celular, a proteína codificada pelo gene E5 parece ainda operar em conjunto com o Fator de Crescimento Epidermóide (EGF) no sentido de favorecer a proliferação celular

O gene E6

A proteína E6 desempenha importante papel nos processos que culminam com  tranformação celular neoplásica, em especial pelo fato dessa proteína interagir de maneira a acelerar os mecanismos de degradação fisiológica da proteína supressora do crescimento tumoral p53, fenômeno esse, que interfere profundamente nos mecanismos de apoptose e reparo do DNA ( Fig.2).

 

                         
        
Fig. 2 – Esquema da interação de E6 com p53. Descrição no texto.


 A função plena da proteína p53 favorece a atividade de outra proteína chamada p21 a qual, por sua vez, diminui a atuação das ciclinas dependentes de quinase levando a parada do ciclo celular.

O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é um co-fator importante na interação entre a fita de DNA e a enzima DNA polimerase delta durante a divisão celular. A proteína p21 estimulada por p53 condiciona inibição do PCNA favorecendo também a parada do ciclo celular.

O gene denominado GADD 45 está envolvido nos mecanismos de reparo do DNA e, ao contrário dos outros dois genes, tem sua atividade estimulada pela proteína p21.
Dessa forma, podemos entender agora que, se a p53 estiver inoperante, um eventual dano genômico que condicione, por exemplo, a ativação de um oncogene será transmitida para células-filhas garantindo um clone de células com vantagens de crescimento em relação às células normais.

Em outras palavras, podemos dizer que a célula infectada por HPV apresenta-se em um estado de instabilidade genômica. Constatou-se também, que E6 interage com as proteínas MCM (minichromossome manteinance) as quais, acredita-se exercerem importante papel regulador nos processos de replicação do DNA.

Outras funções de E6 incluem: a) ativação da enzima telomerase favorecendo mecanismos de imortalização celular, b) transativação da sequência promotora do oncogene c-myc, c) induz aumento na expressão do Receptor do Fator de Crescimento Epidermal (EGFR) (Sonnex, 1998).

Ainda sobre a p53 vale lembrar que para alguns autores essa proteína tem atividade estimuladora sobre a trombospondina. Essa proteína, ao que parece, exerce atividade moduladora da angiogênese deflagrando o processo de neoformação vascular à medida que a p53 tem suas funções comprometidas.

De fato, em recente trabalho onde estudou-se angiogênese nas lesões precursoras do carcinoma do colo uterino, Calux et al (1998) encontraram número maior de capilares neoformados à medida em que essas lesões evoluem para o carcinoma escamoso.

O gene E7

Da mesma  forma que E6, a proteína codificada pelo gene E7 também exerce papel importante nos mecanismos de transformação celular, não através de p53, mas  por interagir com a proteína supressora de tumores pRb (retinoblastoma) e aumentar sua degradação através da via ubiquitina-proteassomo, a mesma via envolvida na degradação de p53.

Outros pontos de interação com E7 incluem a proteína p21 (Fig. 2), p27, ciclina A além de membros da família de fatores de transcrição AP-1 (Sonnex, 1998).


Os genes L1 e L2

Os dois genes tardios (Late) L1 e L2 codificam para as duas proteínas do capsídeo viral.


Integração do genoma viral ao genoma humano

O genoma dos HPV’s, por razões ainda não esclarecidas, pode integrar-se ao genoma humano sendo essa etapa fundamental para a transformação neoplásica.
 Durante o processo de integração parece haver preferência por áreas do genoma humano próximas a oncogenes. Quanto ao genoma viral, esse quase que invariavelmente é rompido nas regiões E1/E2 as quais, entre outras coisas, controlam a transcrição dos genes E6 e E7.

  Nessa condição, E6 e E7 encontrar-se-ão livres de controle transcritivo e, dessa forma, poderão efetivamente interferir nos mecanismos de controle do ciclo celular, como discutido acima.

Os tipos virais que com maior frequência se integram ao genoma humano são os tipos 16 e 18, entretanto, a integração viral também é observada nas infecções virais dos tipos 31, 33 e 35. Esses cinco tipos virais são os mais encontrados nas lesões intraepiteliais precursoras e no próprio carcinoma escamoso do colo uterino.

É importante ressaltar nesse momento, que as infecções por HPV isoladamente não são capazes, por si só, de induzir progressão para neoplasia invasora.

De fato, acredita-se hoje que menos de 2% das lesões induzidas por esse vírus evoluirão para invasão o que demonstra, indubitavelmente, a necessidade de outros eventos moleculares para o surgimento do fenótipo invasivo.

Recente estudo, utilizando-se de técnicas que fornecem o tipo viral específico (PCR), com casuística brasileira demonstrou que em 20% dos casos de infecção pelo HPV existe a presença de mais de um tipo viral causando a infecção (Rousseau et al 2001).
Sabe-se também que em 40% dos casos, trata-se de uma infecção por um vírus de baixo risco e que um dos maiores determinantes de risco para o desenvolvimento do câncer cervical é a persistência de um mesmo vírus de alto risco durante períodos prolongados (Schlecht et al 2001).

Diagnóstico molecular das infecções pelo HPV

Muito embora o padrão ouro de detecção de DNA do HPV seja o “Southern blot”, a sua execução rotineira é laboriosa. Dessa forma, na prática  diária, são basicamente três as técnicas biomoleculares utilizadas na detecção de DNA do HPV: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), Captura Híbrida e Hibridização In Situ.

 PCR: A Reação em Cadeia da Polimerase é um método que se utiliza da síntese enzimática de DNA, determinando amplificação específica e exponencial de um determinado fragmento desse ácido nucleico milhões de vezes. O DNA a ser estudado pode ser coletado por escova endocervical, lavado vaginal, fragmento de biópsia fresco ou blocado em parafina.

As áreas queratinizadas acometidas pelo HPV, via de regra, não fornecem material em quantidade para a pesquisa de infecção viral, especialmente quando se utiliza a escova endocervical para a coleta nessas áreas.

Dessa forma, recomenda-se que uma pequena biópsia seja colocada dentro do tubo de coleta de PCR ou no frasco de captura híbrida caso seja essa a técnica escolhida.
Outro aspecto quanto a coleta do material, diz respeito ao fato de que as reações, de captura híbrida e PCR, não detectarem a localização da lesão uma vez que a obtenção de material com escova somente da vagina, por exemplo, pode conter células da vulva e do colo uterino e vice-versa.

Devido a alta sensibilidade desses métodos os resultados tenderão a ser positivos em todas essas localizações.

Quanto aos locais de passagem da escova, ao nosso ver a infecção pelo HPV deve ser considerada primariamente como uma DST que acomete várias áreas do trato genital inferior e dessa forma entendemos que a coleta deve ser a mais ampla possível, assim, a nossa recomendação é que seja realizada com a mesma escova em face interna de lábios menores, paredes vaginais, fórnices, ecto e endocérvice.
]Vale lembrar que esse é um aspecto controverso existindo autores que recomendam a passagem da escova somente no colo uterino.

 A técnica de PCR utiliza-se de enzima capaz de sintetizar DNA a partir de apenas uma cópia dessa molécula em reação que inclui aquecimentos e resfriamentos sucessivos. Essa enzima foi isolada de algas (Thermus aquaticus) capazes de sobreviver em altas temperaturas no parque de Yellowstone nos EUA.

 A realização dessa reação na presença de primers ou sequências iniciadoras específicas para um determinado tipo viral permite a amplificação do DNA desejado, mesmo que presente em quantidades ínfimas.

 Pode-se ainda lançar mão dos chamados “degenerate primers”, os quais possibilitam, em um único tubo, a pesquisa de vários tipos virais simultaneamente. Nessa eventualidade, existe ainda a necessidade de estudo complementar com enzimas de restrição para se determinar com exatidão o(s) tipo(s) virais (Fig. 3) (Bernard et al; 1994).

Pode-se também lançar mão de seqüênciamento de DNA para a identificação dos tipos virais bem como utilizar-se das variantes de Southern blot como a line-blot e dot-blot com o mesmo objetivo.

 Outras aplicações da técnica de PCR incluem isolamento de novos genes (DD-PCR, RAP-PCR), detecção de translocações e análise da expressão genética (RT-PCR), além de ser possível estimar-se a carga viral.

 Captura Híbrida: Técnica molecular extremamente sensível e de fácil execução sendo reconhecida pelo Food and Drug Administration norte americano (FDA) e Ministério da Saúde brasileiro.

A referida técnica não fornece, de rotina, a tipagem viral específica e sim por grupos (alto e baixo risco), além de fornecer estimativa variável e um tanto quanto controversa da carga viral em determinada amostra.

De fato, a carga viral, de acordo com recente artigo publicado por seus próprios fabricantes, não representa fator preditivo para o surgimento de lesões intraepiteliais de alto grau do colo uterino (Lorincz et al 2002) sendo assim, qualquer que seja o resultado da carga viral utilizando-se captura híbrida este, à luz dos conhecimentos atuais, não possui qualquer valor e portanto não deve ser levado em conta.

Outro aspecto importante com relação a essa técnica é o fato de que a captura hibrida pode interpretar como persistente e portanto de alto risco para câncer, uma infecção que na realidade sofreu mudança do tipo viral, ao longo do tempo, por um outro vírus de alto risco o que descaracterizaria uma infecção persistente se tivesse sido utilizada uma técnica que fornecesse o tipo viral específico. Essa eventualidade, com casuística brasileira é bem discutida por Schlecht et al (2001).

Para a realização da referida técnica, sondas de RNA complementares a áreas específicas do genoma da maioria dos tipos virais são utilizadas.

Caso existam partículas virais, os híbridos formados entre o DNA viral e as sondas específicas são capturados na parede do tubo de reação ou microplaca recobertos com anticorpos específicos marcados com fosfatase alcalina.

As sondas não reagentes são lavadas e a detecção da reação é feita através de adição de substrato quimioluminescente da fosfatase alcalina. A consequente emissão de luz é lida por luminômetro sendo a intensidade da luz proporcional à quantidade de HPV na amostra (Farthing et al. 1994) A captura híbrida, rotineiramente, é realizada em material colhido por escova e biópsias não incluídas em parafina.

Hibridização In Situ: A hibridização in situ constitui técnica que permite a localização de ácidos nucleicos dentro das células, estejam estas nas células ou em preparados citológicos representativos.

Da mesma forma que os outros métodos, baseia-se no pareamento complementar de sondas especificamente projetadas para detectar-se tipo viral específico.

As referidas sondas são préviamente marcadas com substâncias como biotina ou digoxigenina, podendo utilizar-se também de material radioativo se necessário.

Sem dúvida nenhuma, a maior das vantagens com relação à técnica de hibridização in situ diz respeito à possibilidade de detectar-se não somente o tipo viral e a localização das áreas infectadas, mas principalmente o estado físico do vírus, se epissomal ou incorporado ao genoma da célula hospedeira.

É crescente o número de autores que se utilizam dessa técnica com resultados e conclusões importantes principalmente no que tange à presença de partículas virais incorporadas ao genoma, e seu papel prognóstico (Cooper, 1997).

Demonstra-se claramente que as lesões pré HPV induzidas com padrões de hibridização puntiforme (Fig. 3 e 4) possuem partículas virais incorporadas ao genoma constituindo-se em marcador prognóstico importante.

Vale lembrar que a etapa de incorporação ao genoma da célula cervical uterina é fundamental para o estabelecimento da neoplasia invasiva, sendo a hibridização in situ o único dos métodos citados que possibilita identificar pacientes onde o HPV se encontra nesse estado.

Vale ressaltar também que o sucesso da técnica de hibridização in situ depende muito do tempo de formalização das biópsias a qual para fragmentos de até 0,5 cm não precisa ultrapassar 24 horas dentro do formol.

Dessa forma, a grande limitação dessa técnica, além de trabalhosa, reside no fato de que não é possível ter certeza do tempo de formalização do material contido em blocos de parafina vindos de outros serviços por exemplo.

A hibridização in situ pode ser realizada em material blocado em parafina, raspados citológicos frescos ou ainda em biópsias congeladas.